冻存管的冷冻操作是一门学问

　　冻存管冷冻步骤:

　　1、用预热的PBS溶液洗涤细胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆盖细胞(薄薄的液层足够，胰蛋白酶和EDTA的浓度需要根据细胞系确定)。

　　2、37℃孵育细胞3-5分钟。

　　3、细胞从底部脱离之后，终止孵育，加入含有血清的培养基，用移液器轻轻地悬浮细胞。

　　4、离心细胞悬液(500xg,5分钟)，用含有血清的培养基重新悬浮。

　　细胞计数

　　1、离心细胞悬液(500xg,5分钟)，去除上清液，用适量体积的含有血清的培养基重新悬浮细胞。

　　2、以1:1体积比混合细胞和冻存液(60%培养基，20%胎牛血清，20%DMSO)，然后转移到冻存管中。冻存的细胞密度为1-5×106个/毫升。

　　3、含有细胞的冻存管建议以?1K/min的速率降温，可以将冻存管置于?70℃含有异丙醇的容器中。如果冻存管存储其他样品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的气相。为了确保样品冷冻均匀，4mL和5mL的冻存管需要先置于在?20℃冰箱过夜，然后再转移到?70℃或者液氮的气相。

　　4、然后转移冻存管到液氮罐。为了避免污染(如支原体)和安全考虑，请将冻存管置于液氮的气相，切勿置于液相。

　　操作冻存管复苏，全程使用安全防护设备，建议穿实验服、戴棉质手套且在安全的实验台上进行操作。条件允许情况下，请佩戴护目镜或防护面罩。由于夏季室内温度会高于冬季，请格外小心。冻存细胞储存过程中，冻存管的冷冻温度须均匀。不均匀的受冻将会导致冰塞的产生，冰塞会抑制两侧的液体温度传递进而产生危险的高压力并导致冻存管受损。