植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤

　　植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤

　　实验原理

　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)水平。 用纯化的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包 被单抗的微孔中依次加入植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)，再与 HRP 标记的 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗 涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终 的黄色。颜色的深浅和样品中的植物 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)呈正相关。用酶 标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，通过标准曲线计算样品中植物 1,5-二磷酸核酮 糖羧化酶(RubisCO)浓度。

　　试剂盒组成:

　　1 30 倍浓缩洗涤液 20ml×1 瓶

　　7 终止液 6ml×1 瓶 2 酶标试剂 6ml×1 瓶

　　8 标准品(300ng/L) 0.5ml×1 瓶 3 酶标包被板 12 孔×8 条

　　9 标准品稀释液 1.5ml×1 瓶 4 样品稀释液 6ml×1 瓶

　　10 说明书 1 份 5 显色剂 A 液 6ml×1 瓶

　　11 封板膜 2 张 6 显色剂 B 液 6ml×1/瓶

　　12 密封袋 1 个

　　植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)组成及操作步骤 标本要求

　　1.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能 马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

　　2.不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步骤

　　1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。

　　150ng/L

　　5 号标准品

　　150μl 的原倍标准品加入 150μl 标准品稀释液

　　75ng/L

　　4 号标准品

　　150μl 的 5 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

　　37.5ng/L

　　3 号标准品

　　150μl 的 4 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

　　18.75 ng/L

　　2 号标准品

　　150μl 的 3 号标准品加入 150μl 标准品稀释液

　　9.375 ng/L

　　1 号标准品

　　150μl 的 2 号标准品加入 150μl 标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50μl，待测样品孔中先加样品稀释液 40μl， 然后再加待测样品 10μl(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

　　3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。

　　4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用

　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。

　　7. 温育：操作同 3。

　　8. 洗涤：操作同 5。

　　9. 显色：每孔先加入显色剂 A50μl，再加入显色剂 B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色

　　10 分钟.

　　10. 终止：每孔加终止液 50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

　　11. 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。