ELISA实验要点：ELISA结果判断-操作

　　ELISA实验要点：ELISA结果判断-操作
 

　　ELISA试验结果的判断主要根据所做实验的说明书进行,现一般按S/CO进行判断,其中S为样品吸光度,CO为K*阴性对照,K值依据所做实验有所不同。

　　如果没有光度计(酶标仪)靠肉眼判断,则阴、阳性判断主要靠经验。ELISA常用结果判定方法如下：

　　1、 定性测定

　　定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出"有"或"无"的简单回答，分别用"阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得到半定量结果，即用滴度来表示反应的强度，其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。

　　在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。

　　(1) 间接法和夹心法

　　这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性，显色清晰者为阳性。但在ELSIA中，正常人血清反应后常可出现呈色的本底，此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而异，因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物(见3.6)。在用肉眼判断结果时，更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。

　　目视法简捷明了，但颇具主观性。在条件许可下，应该用比色计测定吸光值，这样可以得到客观的数据。先读出标本(sample，S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值，然后进行计算。计算方法有多种，大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。

　　a. 阳性判定值

　　阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A值加上一个特定的常数，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。

　　用此法判断结果要求实验条件十分恒定，试剂的制备必须标准化，阳性和阴性的对照品应符合一定的规格，须配用精密的仪器，并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量标本的实验检测而得到的。现举某种检测HBsAg的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg的复钙人血浆，阳性对照品HBsAg的含量标明为P=9±2ng/ml.每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均数(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400)，试验才有效。3个阴性对照A值均应≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而已另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A值超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阳性判定值=NCX+0.05 标本A值>阳性判定值的为阳性，小于阳性判定值的为阴性。应注意的是，式中0.05为该试剂盒的常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。

　　根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操作不当均会产生"试验无效"的后果。

　　b.标本/阴性对照比值

　　在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对照(N)的A值后，计算S/N值。也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive)，而是病人(patient)的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的间接法ELISA中，有些作者定出S/N为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S/N的阈值。更应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此，这类试剂盒规，如N<0.05(或其他数值)，则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。

　　(2)竞争法

　　在竞争法ELISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感。

　　竞争法ELISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。

　　a. 阳性判定值法

　　与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测抗HBc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc的复钙人血浆，阳性对照中抗HBc含量为125±100u/ml.每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平均值(NCX)和阳性对照A值的平均数(PCX)，两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300)，试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX;如有2个阴性对照A超出以上范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算：

　　阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

　　标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A>阳性判定值的反应为阴性。

　　b. 抑制率法

　　抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算：

　　抑制率(%)= (阴性对照A值-标本A值)×100%/阴性对照A值

　　一般规定抑制率≥50%为阳性，<50%为阴性。

　　2、定量测定

　　ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定大分子量物质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是的检测区域。

　　测定小分子量物质常用竞争法，其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA测定的标准曲线示例见图4-2.注意图中横坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达。

　　新型酶标仪一般带有自动软件可进行定量分析。

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