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攻克ELISA实验,需要搞定那些问题呢?

更新时间:2023-12-13    点击次数:437

  攻克ELISA实验,需要搞定那些问题呢?

  ELISA是蛋白定量的金标准,也是免疫学研究中常用的实验方法之一。很多人觉得ELISA很简单,其实不然。九游代理生物带你了解ELISA实验中出现的各种问题。

  酶联免疫吸附实验

  酶联免疫吸附(ELISA)用于:

  (1)免疫酶染色各种细胞内成份的定位;

  (2)研究抗酶抗体的合成;

  (3)显现微量的免疫沉淀反应;

  (4)定量检测体液中抗原或抗体成份。

  优点:快速、灵敏、定性、定量、定位

  实验原理

  1.包被:抗原/抗体,固相化

  2.反应: 1)待测抗体/抗原; 2)酶标抗原/抗体

  3.洗涤:使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离

  4.底物显色:定性/定量分析


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  常用的酶与底物:

  酶底物显色测定波长辣根过氧化物酶 xidase,HRP邻b二胺(OPD)橘红色492nm四甲基联b胺(TMB)黄色450nm碱性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸盐(p-NPP)黄色405nm终止液:2mol/L H2SO4

  常用方法

  1.间接法

  检测抗体的方法, 主要用于对病原体抗体的检测。

  优势:二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。

  缺点:交互反应发生的机率较高

  2.双抗体夹心法

  检测大分子抗原常用的方法。

  优势:高灵敏、高专一性,抗原无须事先纯化。

  缺点:抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。

  3.竞争法

  检测小分子半抗原(药物、激素等)。

  优势:可适用比较不纯的样本,而且数据再现性很高。

  缺点:整体的敏感性和专一性都较差。

  常见问题分析

  Q1.标曲不显色或显色很弱,样本显色

  溶解标准品以及倍比稀释时,未涡旋震荡或不够充分。

  标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打,效率较低、效果也不一定最佳。

  Q2.标曲和样本均不显色

  在孵育阶段静置在桌面上,这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触,导致显色偏弱。

  推荐孵育阶段,使用ELISA专用的微孔板振荡器,调至合适的频率,使抗原抗体充分接触,保证结合效果。如果排除上述原因,有可能是漏加了某个组分,如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手,一定要做好标记和记录,或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

  Q3.标曲显色,样本不显色

  当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强,就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法,与不同技术结合后,衍生出了多种类型的ELISA,提高了检测灵敏度。

  对于目的蛋白浓度特别低的样本,可以尝试用高敏ELISA,但这也并不意味着一定能检测到样本浓度,只能说可以提高样本的可测率,并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高样本OD值,使之尽量位于标曲范围内,得到的数值也更加可信。

  Q4.标曲和样本都显色,但复孔的CV大

  这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范,就会造成移液的误差较大;实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

  掌握移液器的正确使用和维护。关于个人的操作可练习移液动作、加快速度,确保移液的精密度。

  Q5.本底偏高,样本值测不到

  标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。尤其是样本值特别低的时候,本底过高会掩盖目的信号,导致无法测到样本值。

  在加入TMB显色后,需实时观察标曲显色情况。通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色,即可终止反应。

  Q6.样本经不同梯度稀释,计算得到的样本值差异较大

  有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何,应该如何稀释,那么我们就会做下预实验,确定稀释倍数。然而有时候同一样本做了几个不同梯度稀释后,计算得到的样本值之间差异较大,应该选择哪一个稀释倍数呢?

  这里涉及到了基质效应。通常血清样本加样量较高时,血清中的各种蛋白会抑制抗原抗体的接触,基质效应较明显。而经过稀释后,干扰因素也随之稀释,影响就会较小。当某两个梯度稀释后,计算得到的样本值接近时,我们就可以认为在该稀释梯度时,样本中的干扰因素影响较小,计算得到的值也是接近真实的。然而这样的稀释是针对目的蛋白浓度较高的样本而言。对于浓度很低的样本,经过多倍稀释后,就更加测不到了,此时可按照厂家说明书推荐的加样方式操作。

  Q7.不同试剂盒中的组分能否通用

  除非是公用的试剂如洗液、检测缓冲液,其它组分不建议用其它试剂盒的组分,甚至是同一指标不同批次的试剂盒里的组分。这些组分(包括标准品、标准品稀释液、检测抗体、酶等)都是经过优化的,如果贸然使用其它试剂盒的组分,有可能对结果产生影响。

  elisa试剂盒九游代理一直视质量控制为企业的生命,追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承:遵纪守法,严于律己,宽仁以待,敢于承担的企业精神作为标准,以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场,较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢,是我们的发展目标。九游代理!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作,共创美好的未来。

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