大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)ELISA试剂盒使用说明书

　　大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)ELISA试剂盒使用说明书

　　本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的含量。

　　有效期：6个月

　　保存条件：2-8℃

　　实验原理

　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

　　样本处理及要求

　　1. 血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　2. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　3. 细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

　　需要而未提供的试剂和器材

　　1. 酶标仪(450nm)

　　2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3. 37℃恒温箱

　　4. 蒸馏水或去离子水

　　大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)试剂盒(ELISA)试剂盒组成 名称96孔配置48孔配置备注

　　微孔酶标板8孔×12条8孔×6条无

　　标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无

　　样本稀释液6mL3mL无

　　检测抗体-HRP10mL5mL无

　　20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释

　　底物A6mL3mL无

　　底物B6mL3mL无

　　终止液6mL3mL无

　　封板膜2张2张无

　　说明书1份1份无

　　自封袋1个1个无

　　大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶试剂盒备注：

　　1. 标准品浓度依次为：160、80、40、20、10、0 ng/mL

　　2. 经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

　　注意事项

　　1. 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

　　2. 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

　　3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

　　4. 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

　　5. 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

　　6. 在储存和温育时避免强光直接照射。

　　7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

　　8. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

　　9. 不能使用过期产品。

　　10. 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

　　试剂准备

　　试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

　　20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

　　大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)试剂盒(ELISA)操作步骤

　　1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

　　2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

　　3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

　　4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

　　5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

　　6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7. 每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

　　实验结果计算

　　以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

　　大鼠磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)试剂盒(ELISA)试剂盒性能

　　1. 检测范围：5 ng/mL – 160 ng/mL。

　　2. 灵敏度：检测浓度小于1.0 ng/mL。

　　3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

　　4. 重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

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