Elisa实验：酶联免疫吸附测定类型与操作步骤

　　酶联免疫吸附测定类型与操作步骤

　　双抗体夹心法检测抗原

　　双抗体夹心法是检测抗原常用的方法，但要注意的是在一步法(待测抗原与酶标抗体一起加入反应)测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物"出现钩状效应，甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时，应注意可测范围的高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

　　双抗体夹心法的简要操作步骤为：

　　1)先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面;

　　2)再加样品，使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物;

　　3)加酶标抗抗体(第二种动物抗抗原的酶标抗体);

　　4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗原的量成正比。

　　竞争法检测抗原

　　当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。方法的基本原理可见图2，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

　　竞争法的简要操作步骤：

　　1)先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面;

　　2)加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗原混合物,同时做只加酶标抗原的对照组;

　　3)加入酶促反应底物，发生显色反应，对比实验组及对照组的显色差异，计算未知抗原的量。

　　双抗原夹心法检测抗体

　　双抗原夹心法的反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。

　　双抗原夹心法的简要操作步骤为：

　　1)先加入抗原，使抗体固定结合于载体表面;

　　2)再加样品，使目标检测抗体形成抗原-抗体复合物;

　　3)加酶标抗原;

　　4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比。

　　间接法检测抗体

　　间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体(人免疫球蛋白)，故称为间接法。本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

　　间接法的简要操作步骤：

　　1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原;

　　2)加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗-体复合物;

　　3)加酶标抗抗体;

　　4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比。

　　竞争法检测抗体

　　竞争法测抗体的反应模式与竞争法测抗原类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

　　竞争法的简要操作步骤：

　　1)先加入特异性抗原，使抗原固定结合于载体表面;

　　2)加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗体混合物，并做只加酶标抗体的对照组;

　　3)加入酶促反应底物，发生显色反应，对比实验组及对照组的显色差异，计算未知抗体的量。

　　捕获包被法检测抗体

　　捕获包被法(亦称反向间接法)ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定。以目常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，则后者可干扰IgM的测定。因此先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

　　捕获法测抗体的简要操作步骤：

　　1)特异性捕获抗体的包被，先把能特异性结合待测抗原的抗体固定于固相载体表面;

　　2)加入待测样品，通过固定在载体表面的针对该抗原的抗体固定于载体表面;

　　3)加入特异性抗原以及针对该特异性抗原的酶标抗体;

　　4)加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗体的量成正比。

　　ABS-ELISA法

　　除以上6种ELISA测试方法外，近年在亲和素-生物素系统上又发展出ABS-ELISA法 。亲和素是一种糖蛋白，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成，生物素为小分子化合物。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与抗体或酶形成生物素标记产物，标记方法颇为简便，并且不影响抗体或酶原有的生物学活性。亲和素生物素系统，简称ABS(avidin-biotin system)。由于亲和素与生物素间的亲和力强，结合迅速，且其稳定，使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径，大大提高了检测的灵敏度，但该方法比普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，因此在临床检验中ABS-ELISA应用不多。ABS-ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。

　　在LAB法中，将特异性抗体生物素化、酶分子标记在亲和素分子上，生物素化抗体与被检抗原结合后，再借BAS的高度亲和力将酶分子联结到抗原分子上，经酶促反应即可检出抗原，因此提高检测的敏感度。

　　ABC法同样将特异性抗体生物素化、酶分子标在生物素上，亲和素和酶标生物素需要先按一定比例形成ABC复合物，这种网络结构结合了大量的酶分子，当亲和素尚未被酶标生物素饱和时，生物素化抗体即可与之结合, 使被检抗原、生物素化抗体和酶标生物素联成一体。

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