人促胰岛生长素(betatrophin)elisa试剂盒

　　人促胰岛生长素(betatrophin)elisa试剂盒

　　本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

　　本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人促胰岛生长素(betatrophin)的含量。

　　有效期：6个月

　　保存条件：2-8℃

　　试剂盒组成：

　　备注：

　　1.(96T/48T)打开包装后请及时检查所有物品是否齐全。

　　2.标准品浓度依次为：800、400、200、100、50、25 ng/L

　　3.经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用ye将标本进行适当稀释后再进行实验。

　　检测前准备工作：

　　1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。

　　2.从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象;放置室温，轻摇均匀，待结晶溶解后再配置洗涤液。可将20ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水稀释配置成400ml工作浓度的洗涤液，未用完的放回4℃

　　3.20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

　　实验原理：

　　试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被人胰岛生长素(betatrophin)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胰岛生长素(betatrophin)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值)，计算样品浓度。

　　实验所需自备试验器材：

　　1.酶标仪(450nm)

　　2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

　　3.37℃恒温箱

　　4.蒸馏水或去离子水

　　人促胰岛生长素(betatrophin)ELISA试剂盒样本处理及要求：

　　1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20 分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃ 1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　3.组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果)，称重后将组织jian碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

　　4.细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

　　5.其它生物标本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

　　6.样品外观：样品应清澈透明，悬浮物应离心去除。

　　7.样品保存：样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(6个月内检测)，避免反复冻融，标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

　　注意事项：

　　1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

　　2.洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

　　3.消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

　　4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

　　5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

　　6.在储存和温育时避免强光直接照射。

　　7.平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

　　8.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

　　9.不能使用过期产品。

　　10.如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

　　操作步骤：

　　1.从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

　　2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

　　3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。

　　4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

　　5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

　　6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

　　7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

　　实验结果计算：

　　绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

　　人促胰岛生长素(betatrophin)ELISA试剂盒性能：

　　1.检测范围：25 ng/L – 800 ng/L。

　　2.灵敏度：检测浓度小于1.0 ng/L。

　　3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

　　4.重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

　　技术小提示：

　　1.当混合或重溶蛋白溶液时，尽量避免起沫。

　　2.为了避免交叉感染，配置不同浓度标准品、上样、加不同试剂都需要更换枪头。另外不同试剂请分别使用不同的移液槽。

　　3.每次孵育时，请正确使用封板胶可保证结果的准确性。

　　4.混合后的显色底物在上板前应为无色，请避光保存;假如微孔板后，将由物色变成不同深度的蓝色。

　　5.终止液上板顺序应同显色底物上板顺序一致;加入终止液后，孔内颜色由蓝变黄;若孔内有绿色，则表明孔内液体未混匀;请充分混合。

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